Вегерина, Бирюк, Шабанов (2014) Сравнение устойчивости сперматогенеза

УДК 597.851(576.354.4)

Порівняння стійкості сперматогенезу в геміклонального міжвидового гібрида Pelophylax esculentus і батьківського виду Pelophylax ridibundus (Amphibia, Anura)

А.О. Вегерина, О.В. Бірюк, Д.А. Шабанов

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, пл. Свободи, 4, Харків, 61077 Україна

E-mail: anastasia.vegerina@gmail.com; mykhailova.o.v@gmail.com; d.a.shabanov@gmail.com

Порівняння стійкості сперматогенезу в геміклонального міжвидового гібрида Pelophylax esculentus і батьківського виду Pelophylax ridibundus (Amphibia, Anura). Вегерина А.О., Бірюк О.В., Шабанов Д.А. — Представлені результати каріологічного вивчення клітин зародкової лінії самців міжвидових гібридів Pelophylax esculentus і одного з його батьківських видів, P. ridibundus. Анеуплоїдні клітини були зареєстровані як у гібридів, так і в особин батьківського виду, однак середня зустрічальність сперматоцитів I з неправильною кількістю бівалентів суттєво вища в P. esculentus. Діапазон змін частки нормальних клітин в особин у межах вибірки гібридів варіює значно ширше, ніж у P. ridibundus. Ми зробили висновок про відносну нестійкість механізму геміклонального успадкування, яка приводить до утруднень сперматогенезу й зниження ефективності відтворення міжвидових гібридів.

Ключові слова: Pelophylax esculentus, сперматогенез, порушення, анеуплоїдія, геміклональність.

Comparison of spermatogenesis stability in hemiclonal interspecific hybrid Pelophylax esculentus and parental species Pelophylax ridibundus (Amphibia, Anura). Vegerina A.O., Biriuk O.V., Shabanov D.A. — The article presents the results of karyological study of male germline cells of interspecific hybrid Pelophylax esculentus and one of its parental species P. ridibundus. Aneuploid cells were detected in both, hybrids and parental species individuals, but the average frequency of spermatocytes I with the wrong number of bivalents is significantly higher in P. esculentus. The range of changes in the normal cells proportion among the individualsin the sample of hybrids varies significantly wider than among P. ridibundus. We have concluded that the comparative instability of hemiсlonal inheritance mechanism leads to difficulties in spermatogenesis and reduction of the interspecific hybrids reproductive efficiency.

Key words. Pelophylax esculentus, spermatogenesis, abnormalities, aneuploidy, hemiclonality.

Вступ

До гібридогенного комплексу зелених жаб (Pelophylax esculentus complex) входять два батьківські види: ставкова жаба, Pelophylax lessonae (Camerano,1882) і озерна жаба, Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771), а також їх гібриди (Berger, 1964). Для позначення міжвидових гібридів з низки причин використовується назва, аналогічна видовій — їстівна жаба, Pelophylax esculentus (Linnaeus, 1758). Як правило, у P. esculentus у гамети переходить тільки один батьківський геном, який без рекомбінації (клонально) успадковується в ряду поколінь (Tunner, 1974). Таке відтворення називається геміклональним (Plötner, 2005). У типовому випадку P. esculentus мешкають і відтворюються спільно з представниками одного або обох батьківських видів, утворюючи геміклональні популяційні системи, ГПС (Шабанов, Литвинчук, 2010). Для регіону, названого Сіверсько-Донецьким центром різноманіття зелених жаб, характерні ГПС, що складаються з диплоїдних і триплоїдних P. esculentus, а також P. ridibundus (Шабанов, Литвинчук, 2010). P. lessonae у цьому регіоні відсутня, і всі її геноми передаються через міжвидових гібридів, P. esculentus.

Геміклональне відтворення гібридів забезпечується специфічним характером гаметогенезу, який, по суті, є аномальним (при порівнянні з типовим, характерним для представників батьківських видів). Геноми батьківських видів P. esculentus complex відрізняються настільки, що типовий мейоз у гібрида виявляється неможливим. Адаптація, що дозволяє обійти це утруднення, полягає в тому, що з клітин зародкової лінії ще до початку мейозу видаляється один з батьківських геномів. У серії цитогенетичних досліджень із застосуванням флуоресцентної мікроскопії австрійські автори Х. Туннер і С. Хеппіх-Туннер показали, що видалення неклонального геному відбувається під час мітотичних поділів клітин зародкової лінії. Після цього клональний геном подвоюється (дуплікується), причому цей процес протікає до вступу клітин у мейоз або ж у самок може відбуватися вже в ході мейозу (Tunner, Heppich-Tunner, 1991). У триплоїдних особин гаметогенез протікає аналогічно, за винятком стадії подвоєння (Vinogradov et al., 1991; Plötner, 2005). Унаслідок таких аномальних процесів у гібридних жаб, порівняно з представниками батьківських видів, відтворення стикається з низкою труднощів, до числа яких належать порушення розвитку гонад, аномалії личинкового розвитку, поява мозаїчних особин, зменшення життєздатності й тривалості життя (Berger, 2008; Михайлова та ін., 2011).

Особливості гаметогенезу представників Сіверсько-Донецького центру різноманіття зелених жаб вивчалися із застосуванням різних методик, у тому числі за допомогою проточної ДНК-цитометрії суспензії сперматозоїдів (Боркін та ін., 2005); отримання метафазних пластинок із зруйнованих клітин (Сурядна, 2003; Маніло та ін., 2007); за допомогою електрофоретичного аналізу суспензії статевих клітин (Межжерін та ін., 2007; Морозов-Леонов та ін., 2009). Роботи з вивчення овогенезу P. esculentus проводили також за допомогою маркерів хромосом типу лампових щіток і методики FISH (Dedukh et al., 2015).

Крім іншого, для вивчення сперматогенезу застосовували каріоаналіз у давлених препаратах (Михайлова та ін., 2011). На підставі результатів перелічених робіт можна стверджувати, що в багатьох клітинних лініях гібридів гаметогенез, який можна вважати для них нормальним (з урахуванням його аномальності порівняно з типовим випадком рекомбінантного успадкування), порушується. Наслідком таких порушень є поява значної кількості анеуплоїдних і поліплоїдних клітин зародкової лінії (найімовірніше, у переважній більшості тих, що не доходять до стадії зрілих гамет). Це означає, що у P. esculentus у зв'язку з геміклональним успадкуванням процес утворення гамет протікає нестійко. Однак отримані результати мають описовий характер, кількісний облік порушень у ході гаметогенезу, який дозволив би оцінити вантаж геміклональності, до цього моменту не проводився.

На підставі вищесказаного можна стверджувати, що порівняння стійкості сперматогенезу в диплоїдних міжвидових гібридів зелених жаб (P. esculentus) і батьківських видів гібридогенного комплексу становить значний інтерес. У зв'язку з цим, завданням даної роботи стало опис і підрахунок аномальних мітотичних і мейотичних пластинок у сім'яниках гібридів P. esculentus і одного з батьківських видів P. ridibundus. Для цього ми застосовували метод каріоаналізу за препаратами розкапаних клітин.

Матеріал і методи

Ми дослідили вибірку з 23 особин зелених жаб, до якої входили 10 диплоїдних самців P. esculentus і 13 самців P. ridibundus із Сіверсько-Донецького центру різноманіття P. esculentus complex. Жаб відловили з червня по жовтень 2013 р. в околицях с. Гайдари, с. Геніївка і с. Суха Гомільша Зміївського району Харківської області, а також у межах міста Харкова (вулиця Тимурівців). Видову належність жаб визначали за комплексом зовнішніх ознак (Шабанов та ін., 2006). Для особин, зібраних у межах міста, склад геному був визначений за допомогою проточної ДНК-цитометрії, яка виконувалася Ю.М. Розановим і С.М. Литвинчуком у ЦІН РАН (м. Санкт-Петербург). Для проведення каріологічного аналізу у тварин були взяті фрагменти кишечника й сім'яники. Для непрямого визначення плоїдності в зелених жаб отримували й досліджували мазки крові згідно з опублікованою методикою (Бондарева та ін., 2012).

Кожна досліджувана особина за добу до забою отримувала внутрішньоочеревинну ін'єкцію 0,04% водного розчину колхіцину по 0,1–0,3 мл (залежно від маси). Отримані в ході розтину матеріали промивали, розрізали на фрагменти й поміщали в гіпотонічний розчин (0,07М КCl), на 20 хв. Потім розчин замінювали фіксатором Карнуа (3 частини метанолу й одна частина крижаної оцтової кислоти), при цьому зміну фіксатора проводили тричі через кожні 30 хв. З фіксованих матеріалів готували каріологічні препарати методом розкапування. Для цього фрагмент тканини переносили в 70% розчин оцтової кислоти, де він мацерувався до утворення суспензії клітин. Отриману суспензію наносили на нагріті до 60°C на нагрівальному столику предметні скла за допомогою пастерівської піпетки у вигляді крапель діаметром 1 см. Нанесені краплі негайно забирали піпеткою, у результаті чого на склах залишалася невелика кількість окремо лежачих клітин. Препарати висушували й поміщали в термостат при температурі 37°C на 3 тижні.

Остаточне визначення плоїдності проводили за допомогою підрахунку хромосом (26 для диплоїдів або 39 для триплоїдів) у не менш ніж семи метафазних пластинках із соматичної тканини кожної особини. У випадку, коли метафазних пластинок, придатних для підрахунку в них хромосом, було недостатньо, плоїдність визначали на підставі числа ядерець у ядрах не менш, ніж 20 клітин. Для цього нами було використане забарвлення нітратом срібла (сріблення) — метод, застосовуваний для виявлення району ядерцевого організатора (РЯО, сайти 18S + 28S рДНК) у метафазних хромосомах, а також ядерець в інтерфазних ядрах соматичних клітин (Birshtein, 1984; Schmid, 1982). У результаті сріблення ядерця стають чітко видні як темні ділянки: два в ядрах диплоїдних особин, і, відповідно, три — у ядрах триплоїдних (Вегерина та ін., 2013). Забарвлені нітратом срібла препарати поміщали в 2% розчин барвника Гімзи, а потім промивали в дистильованій воді й висушували. Усі вивчені нами особини виявилися диплоїдними.

На отриманих препаратах сім'яників вибирали клітини, що перебувають на різних стадіях мітотичного або мейотичного поділу. Придатні для аналізу пластинки мікроскопіювали зі збільшенням у 160, 640 і 1600 разів з масляною імерсією й фотографували за допомогою цифрової USB-камери для мікроскопа (ScienceLab View.7). На отриманих фотографіях проводили підрахунок структур у пластинках на стадіях метафази мітозу, а також стадії діакінезу й метафази I мейозу, у яких кількість і структура хромосом або бівалентів видні найбільш чітко.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програми Statistica.

Результати й обговорення

У сім'яниках зелених жаб нами було зареєстровано значну кількість анеуплоїдних клітин, тобто клітин, що мають кількість хромосом, некратну гаплоїдному набору. Анеуплоїдні клітини ми спостерігали на різних стадіях гаметогенезу, причому як у гібридних особин, так і в особин батьківських видів. Число хромосом у таких клітинах коливалося в дуже широких межах. У той час як диплоїдний набір у зелених жаб становить 26 хромосом (рис. 1), ми реєстрували гіпогаплоїдні (менше 13), гіпергаплоїдні (більше 13), гіподиплоїдні (менше 26) і гіпердиплоїдні (більше 26) пластинки (рис. 2). Наявність гіпогаплоїдних, гіпергаплоїдних і гіподиплоїдних пластинок частково можна було б пояснити втратами при виготовленні каріологічних препаратів методом розкапування або, інакше кажучи, списати на похибку методу. Утім, слід урахувати, що у використаному нами варіанті каріоаналізу проходило розкапування не вільно зважених метафазних пластинок (що підвищує ймовірність втрати частини хромосом або накладення пластинок), а цілих клітин, що різко зменшує ймовірність помилок. Ще складніше було б пояснити похибкою методу появу гіпердиплоїдних пластинок. Їх наявність прямо вказує на порушення в характерному для P. esculentus механізмі гаметогенезу. Нарешті, слід указати, що характер просторового розподілу хромосом указує на те, що збільшення плоїдності відбувалося в результаті порушень розходження, а не накладення різних пластинок.

Рис. 1. Сперматогоній диплоїдного самця P. esculentus. 2n метафаза мітозу, 26 хромосом: А — метафазна пластинка; В — каріограма.
Fig. 1. P. esculentus diploid male’s spermatogonia. 2n metaphase of mitosis, 26 chromosomes: A — metaphase plate; B — karyogram.

Рис. 2. Анеуплоїдні сперматогонії диплоїдних самців P. esculentus. Гіподиплоїдний набір хромосом на стадії метафази мітозу, 22 хромосоми: А — метафазна пластинка; В — каріограма. Гіпердиплоїдний набір хромосом на стадії метафази мітозу: C — метафазна пластинка; D — каріограма.
Fig. 2. Aneuploid spermatogonia of P. esculentus diploid males. Hyperdiploid chromosome set in metaphase of mitosis, 22 chromosomes: A — metaphase plate, B — karyogram. Hypodiploid chromosome set in metaphase of mitosis, 28 chromosomes: C — metaphase plate; D — karyogram.

У мейозі ми також спостерігали анеуплоїдні й подвоєні набори бівалентів і, крім того, порушення в утворенні самих бівалентів — униваленти, кількість яких, у свою чергу, також могла бути некратною гаплоїдному набору (рис. 3). Слід зазначити, що іншими авторами, які вивчали самок P. esculentus, також були відмічені як анеуплоїдні клітини серед оогоніїв (Tunner, Heppich-Tunner, 1991), так і ооцити, що містять униваленти, подвоєне число бівалентів і навіть біваленти й униваленти одночасно (Dedukh et al., 2015). У сім'яниках трьох диплоїдних самців P. esculentus крім анеуплоїдних пластинок були знайдені поліплоїдні — 3n і 4n пластинки (рис. 4). Слід підкреслити, що в цих особин у соматичних тканинах спостерігали тільки диплоїдні набори хромосом і розмір еритроцитів також коливався в межах, що відповідають розмірам диплоїдних клітин (Бондарева та ін., 2012).

Рис. 3. Сперматоцити I диплоїдних самців P. esculentus: А — профаза I мейозу, 13 бівалентів (норма); В — профаза I мейозу, 26 бівалентів; С — 13 унивалентів.
Fig. 3. P. esculentus diploid male’s spermatocytes I: A — prophase I of meiosis; 13 bivalents (normal); B — prophase I of meiosis, 26 bivalents; C — 13 univalents.

Рис. 4. Cперматогонія диплоїдного самця P. esculentus. Метафаза мітозу, 51 хромосома (норма — 4n = 52), одна хромосома з 5-ї пари відсутня: А — метафазна пластинка; В — каріограма.
Fig. 4. P. esculentus diploid male’s spermatogonia. Metaphase of mitosis, 51 chromosomes (normal — 4n = 52), one chromosome in 5-st pair have been lost: A — metaphase plate; B — karyogram.

У цілому зареєстрована для P. esculentus картина аномалій відповідала результатам попередніх досліджень, проведених нами з використанням іншого методу (Михайлова та ін., 2011). Крім того, ці результати збігаються з даними інших авторів по жабах з Харківської області (Сурядна, 2005; Маніло та ін., 2007, Dedukh et al., 2015), а також перегукуються з даними, отриманими при вивченні популяцій зелених жаб із західної Європи (Günther, 1975; Tunner, Heppich-Tunner, 1991).

У сім'яниках P. ridibundus аномальні клітини з неправильною кількістю структур зустрічалися рідше, ніж у гібридних особин. Усі зареєстровані порушення P. ridibundus були аналогічні описаним вище для P. esculentus. У одного з самців озерної жаби нами була зареєстрована поліплоїдна клітина з хромосомним набором, що перевищує триплоїдний (n = 47). Імовірно, це була тетраплоїдна пластинка, що зазнала втрат. Подібне відхилення від норми у P. ridibundus реєструвалося й описувалося раніше іншими авторами (Günther, 1975; Маніло, Радченко, 2010).

Проведений за допомогою U-критерію Манна-Уітні аналіз відмінностей між вибірками гібридів і особин батьківського виду за кількістю нормальних клітин (з кількістю бівалентів рівною тринадцяти) показав, що відмінність цих вибірок є значимою (p = 0,0015). Чітко видно (рис. 5), що середня частка нормальних сперматоцитів від їх загальної кількості для вивчених особин P. ridibundus (0,86) більш, ніж у півтора раза перевищує таку для P. esculentus (0,51), причому діапазон змін цієї частки в особин їстівних жаб значно ширший. У цілому частка нормальних сперматоцитів I серед усіх вивчених пластинок P. ridibundus склала 0,75, а для P. esculentus — 0,40. Більш низька загальна частка нормальних клітин P. ridibundus серед вивчених нами клітин (0,75) відрізняється від середньої частки таких клітин, установлених нами для цього виду (0,86). Ця відмінність є наслідком того, що ми більш ретельно досліджували особин батьківського виду з підвищеною частотою аномалій у каріотипах: від кожної такої особини ми вивчили більшу кількість клітин.

Рис. 5. Cередні значення й довірчі інтервали часток сперматоцитів I порядку c нормальною кількістю бівалентів (n = 13).
Fig. 5. Mean values and confidence intervals of spermatocytes I with a normal amount of bivalents (n = 13) share.

На рисунку 6 показано розподіл частот зустрічальності сперматоцитів I порядку з певним числом бівалентів. Добре видно, що зустрічальність клітин з неправильною кількістю бівалентів суттєво вища для P. esculentus. При цьому межі, у яких змінюється кількість структур у сперматоцитах, в їстівних жаб дещо ширші, ніж в озерних. Імовірно, значна частка таких аномальних клітин на наступних етапах сперматогенезу відсіюється. Можливо, утім, що частина цих клітин може пройти всі стадії гаметогенезу, даючи початок анеуплоїдним сперматозоїдам. Цікава також наявність невеликого піку у P. esculentus для n = 26. Це означає, що в сім'яниках диплоїдних гібридів утворюється деяка кількість тетраплоїдних клітин, які потім могли б привести до утворення диплоїдної сперми. Незважаючи на більш ніж десятилітню історію вивчення Сіверсько-Донецького центру різноманіття зелених жаб, досі залишається нез'ясованим питання, у результаті яких схрещувань у ньому виникають триплоїдні P. esculentus. Утворення диплоїдними гібридними самцями диплоїдної сперми є одним з потенційних пояснень феномену появи триплоїдів.

Рис. 6. Розподіл частот зустрічальності різних наборів бівалентів у всій вивченій сукупності клітин P. ridibundus і P. esculentus.
Fig. 6. The arrangement of different bivalent sets frequencies of occurrence in the totality of P. ridibundus and P. esculentus cells studied.

Таким чином можна зробити висновок, що геміклональність у міжвидових гібридів зелених жаб є менш стійким механізмом успадкування, ніж утворення рекомбінантних гамет, характерне для представників батьківських видів. Відносна нестійкість гаметогенезу гібридів повинна приводити до зниження ефективності їх відтворення. Однак слід узяти до уваги, що, навіть з урахуванням описаних аномалій, геміклональне успадкування як природно виникаючий спосіб подолання гібридної стерильності забезпечує масове відтворення P. esculentus при схрещуванні з батьківськими видами.

На думку авторів, апробований у цій роботі методичний підхід потребує застосування до ширшого матеріалу. Бажано оцінити частку аномалій у ході сперматогенезу в іншого батьківського виду, P. lessonae. Інтерес становить з'ясування того, як співвідноситься рівень аномалій при сперматогенезі в гібридів F1, що виникають від схрещування батьківських видів, і в гібридів, що передавали клональний геном у значній кількості поколінь. Можна припустити, що рівень аномалій гаметогенезу в батьківських видів, що мешкають у ГПС разом з гібридами, буде відрізнятися від такого в представників того ж виду, що походять зі звичайних моновидових популяцій, і не контактують з гібридами.

Бондарева А.А., Бібик Ю.С., Самило С.М., Шабанов Д.А. Цитогенетичні особливості еритроцитів зелених жаб із Сіверсько-Донецького центру різноманіття Pelophylax esculentus complex // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Сер. біологія. — 2012. — Вип.15, № 1008. — С. 116–123. — /Бондарева_2012_Цитогенетические

Боркін Л.Я., Зіненко А.І., Коршунов А.В. та ін. Масова поліплоїдія в гібридогенному комплексі Rana esculenta (Ranidae, Anura, Amphibia) на Сході України // Мат. I конф. Українського Герпетологічного Товариства. — К.: Зоомузей ННПМ НАНУ, 2005. — С. 23–26. — /Боркин_др_2005_Полиплоидия

Вегерина А.О., Мелешко Е.В., Пиріна І.С. та ін. Визначення співвідношення диплоїдів і триплоїдів серед метаморфів зелених жаб у Cіверсько-Донецькому центрі різноманіття Pelophylax esculentus complex // Вісник Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна. Сер. біологія. – 2013. — Вип.18, № 1079. — С. 107–113. — /Вегерина_др_2013_Метаморфи.

Маніло В.В., Радченко В.І., Коршунов А.В. Дослідження каріотипу їстівної жаби (Rana kl esculenta) з Харківської області України // Наук. вісник Ужгород. ун–ту. Сер. Біологія. — 2007. — Вип. 21. — С. 68–73.

Маніло В.В., Радченко В.І. Каріологічне дослідження Pelophylax ridibundus (Anura, Amphibia) східної частини України // Збірник праць Зоологічного музею. — 2010. — № 41 — С. 111–121.

Михайлова О.В., Кечеджі А.Е., Шабанов Д.А. Вивчення сперматогенезу в диплоїдних Pelophylax esculentus (Amphibia, Anura) за допомогою каріоаналізу в роздавлених препаратах // Праці Українського герпетологічного товариства. — 2011. — № 3. — С. 120–127. — /Михайлова_др_2011_Сперматогенез_диплоидов

Михайлова О.В, Усова О.Є., Шабанов Д.А. Як оцінити популяційний вантаж, що пов'язаний з геміклональною гібридизацією в популяційних системах Pelophylax esculentus complex? // Біологія та валеологія. — Вип. 13 — Харків : ХДПУ, 2011. — С. 44–50.

Морозов-Леонов С.Ю., Межжерін С.В., Некрасова О.Д. та ін. Успадкування батьківських геномів гібридною формою Rana “esculenta” (Amphibia, Ranidae) / // Генетика. — 2009. — Том 45, № 4. — С. 488–495.

Сурядна Н. Н. Матеріали з каріології зелених жаб (Rana ridibunda, Rana lessonae, Rana esculenta) з території України // Вестн. зоол. — 2003. — 37, № 1. — С. 33–40.

Шабанов Д.А., Зіненко А.І., Коршунов А.В. та ін. Вивчення популяційних систем зелених жаб (Rana esculenta complex) у Харківській області: історія, сучасний стан і перспективи // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Біологія. — 2006. — Вип.3, №729. — С. 208–220.

Шабанов Д.А., Литвинчук С.М. Зелені жаби: життя без правил або особливий спосіб еволюції? // Природа. — 2010. — № 3 (1135). — С. 29–36. — /Лягушки

Dedukh D., Mazepa G., Shabanov D. et al. Optional endoreplication and selective elimination of parental genomes during oogenesis in diploid and triploid hybrid european water frogs // Plos One. — 2015. — 10, N 4. — P. 1–19.

Berger L. Is Rana esculenta lessonae Camerano a distinct species? // Ann. Zool. PAN. — 1964. — 22, N 13. — P. 245–261.

Berger L. European green frogs and their protection. — Poznan : Fundacja Biblioteka Ekologiczna, 2008. — 72 p.

Birstein V.J. Localization of NORs in karyotypes of four Rana species // Genetica. — 1984. — N 64. — P. 149–154.

Günther R. Untersuchungen der meiose bei mänchen von Rana ridibunda Pall., Rana lessonae Cam. und der bastardform „Rana esculenta“ L. (Anura) // Biologisches Zentralblatt. — 1975. —.94, N 3. — S. 277–294.

Plötner J. Die westpaläarktichen Wasserfrösche. — Bielefeld : Laurenti-Verlag, 2005. — 161 S.

Schmid M. Analysis of the Structure and Variability of NORs in Anura // Chromosoma. — 1982. — N 87. — P. 327–344.

Tunner H. G. Die Klonale Struktur einer Wasserfroschpopulation // Z. zool. Syst. und Evolut.-forsch. — 1974. — 12, N 4. — S. 309–314.

Tunner H.G., Heppich-Tunner S. Genome Exclusion and Two Strategies of Chromosome Duplication in Oogenesis of a Hybrid Frog // Naturwissenschaften. — 1991. — 78. — P. 32–34.

Vinogradov A.E., Borkin L.J., Günther R., Rosanov J.M. Genome elimination in diploid and triploid Rana esculenta males: cytological evidence from DNA flow cytometry // Genome. — 1991. — 33. — P. 619–627.